|
临床方面研究
基础方面研究  腹主动脉瘤相关功能蛋白的筛选与功能研究
采用先进的固相PH梯度双向凝胶电泳技术分离腹主动脉瘤组织中的总蛋白，通过与正常组的比较找出有差异的蛋白质点。回收这些蛋白质点进行胶内酶解，并用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对酶解产物进行分析，结合等电点，分子量，修饰分布情况等参数，确定这些差异蛋白质的来源和分子生物学性状。在正常对照组血清蛋白的2-D图谱中，已发现一组区别于病例组的具有特征性的由6个蛋白质点组成的蛋白质谱图。经过质谱鉴定以及两大蛋白质数据库（NCBInr及SWISS-PROT）的相互验证，鉴定出差异表达的蛋白分属于：haptoglobin/haptoglobin precursor(触珠蛋白/触珠蛋白前体)Apolipoprotein L(载脂蛋白L家族)，C4A6蛋白，PRO2044蛋白。其中，我们采用免疫印迹技术利用单克隆抗体（Anti-human haptoglobin）已经验证了触珠蛋白载正常对照血清具有高表达，而在腹主动脉瘤病例血清中无表达或低表达。
研究结果表明，触珠蛋白可能是一种保护蛋白，它的低表达可能与粥样硬化性动脉疾病的发生发展有关。
一氧化氮诱导血管平滑肌细胞凋亡在腹主动脉瘤形成中作用的研究 研究结果证明了在弹性蛋白酶灌注诱导的大鼠腹主动脉瘤组织中，存在诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达上调产生的过量一氧化氮（NO），一氧化氮可诱导血管平滑肌细胞凋亡，促进腹主动脉瘤形成和发展。应用特异性iNOS抑制剂可以减少NO的产生和血管平滑肌细胞凋亡，从而抑制腹主动脉瘤的扩张。
纤溶系统调节因子及免疫蛋白在腹主动脉瘤形成合发展中作用的研究 研究结果发现，腹主动脉瘤组织中组织型纤溶酶原激活物（t-PA）,尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA），纤溶酶原激活物抑制剂－1（PAI-1）的mRNA表达水平比正常对照组明显上调，三者在腹主动脉瘤的形成和发展中可能均产生作用。u-PA、PAI-1蛋白表达量均增加，但由于产生的部位和量的差别，以致PAI－1对U-PA 不能完全抑制，使U-PA在腹主动脉瘤中得以持续产生作用。
基因转染修饰的骨髓间质干细胞治疗下肢动脉缺血症 利用转染血管内皮细胞一氧化氮合成酶（eNOS）的骨髓间质干细胞治疗下肢动脉缺血症。将载有eNOS的腺病毒载体转染体外培养的大鼠骨髓间质干细胞，经系统性静脉注射和小腿肌肉注射方式治疗下肢动脉缺血症，检测下肢缺血部位新生血管形成情况。证实外源性补充骨髓间质干细胞可促进缺血部位新生血管形成，并比较系统性静脉注射与局部肌肉注射基因治疗方法的优缺点，此研究正在与美国同行合作进行中。
转基因血管内皮细胞和血管内皮干细胞自分泌生长因子促新生血管形成的实验研究 研究建立自分泌转基因治疗严重下肢动脉缺血症的动物模型，以提高基因治疗严重下肢动脉缺血症的疗效。将VEGF基因转染到血管内皮干细胞中，建立自分泌血管生长因子模型，增加局部血管生长因子浓度，更有效地促进血管内皮细胞及周围支持细胞的增殖与增生，以达到血管重建；利用近年来新发现的血管内皮细胞另一种特异性酪氨酸激酶受体Ang1与VEGF的协同作用，将它们联合转染到血管内皮细胞表达，产生更强的促进血管重建作用。现正在进行的研究为：分离自体血管内皮干细胞，分别转染pVEGF, pAng1, pVEGF+pAng, 体外观察转染不同因子的血管内皮干细胞的形态变化；并自体移植于严重下肢动脉缺血症动物模型，体内观察新生血管和侧支循环建立情况。
血管内皮干细胞促新生血管形成中促细胞募集因子的克隆研究 采集脐带血中单核细胞，磁珠分离法提取CD34阳性血管内皮干细胞，建立含促募集作用的干细胞源性血管生成模型，应用Transwell分离共培养系统促进CD34阳性血管内皮干细胞分化，与对照组总蛋白进行二维蛋白质电泳分析，筛选两者差异蛋白，并用质谱分析技术鉴定相关蛋白性质，合成该差异蛋白因子，研究该蛋白对于CD34＋血管内皮干细胞分化的作用。
一氧化氮合酶在动脉硬化闭塞性疾病中作用的研究 研究结果表明，内皮细胞型一氧化氮合酶蛋白在动脉硬化闭塞和血栓闭塞性 脉管炎内膜的表达减少是动脉硬化闭塞性疾病发生的因素之一。
下肢动脉硬化性闭塞疾病的蛋白组学研究 在广东省社会发展计划重大科技专项的资助下，开展粥样硬化性动脉疾病的血清蛋白质组学研究。寻找和鉴定血清中特异的蛋白质点或谱，为早期诊断和疾病进程监控提供灵敏、特异的分子标记物；通过对这些蛋白质序列的分析，与相关的mRNA, DNA建立联系，开展蛋白质功能方面的研究。为进一步阐明粥样硬化性疾病的发病机制提供科学依据；开发潜在的具有药效学意义的治疗靶点，为早期干预提供科学依据。
Pep1介导血管生成因子进入内皮干细胞治疗严重下肢动脉缺血的实验研究 从人外周血分离内皮干细胞并在体外培养扩增，同时制备Pep1/VEGF和Pep1/Ang1融合蛋白，再将内皮干细胞分别与这两种融合蛋白孵育，将VEGF和Ang1转导入内皮干细胞，随后将导入了细胞因子蛋白的内皮干细胞由尾静脉注入裸鼠体内，初步研究结果发现可有效提高下肢缺血区内皮干细胞和血管内皮细胞数量，以及新生血管形成数量明显增多。
下肢深静脉瓣膜功能不全所致大隐静脉曲张致病相关基因的筛选与克隆 应用荧光差异显示mRNA差异显示技术研究CVI病人曲张大隐静脉组织中基因表达情况的改变。到目前为止，共发现曲张静脉组织中37条cDNA片段的差异表达，其中8条已经得到RT-PCR证实，包括六个已知基因片段和两个未知来源的基因片段。已经得到证实的八个片段中，表达上调的有Homo sapiens NADH dehydrogenase subunit 6，Homo sapiens ras homolog gene family, member E (RhoE)，Homo sapiens McKusick-Kaufman syndrome (MKKS)和一个未知基因，表达下调的有 transcript variant 1，Homo sapiens desmuslin (DMN) transcript variant A mRNA，Homo sapiens cDNA FLJ13274 fis, clone OVARC1001029，Homo sapiens cDNA FLJ30404 fis, clone BRACE2008481和另一个未知基因。在此基础上，我们又用Western blotting对CVI曲张大隐静脉和正常大隐静脉组织中的desmuslin蛋白含量进行检测，发现desmuslin蛋白在正常静脉管壁组织中的含量明显高于病变静脉管壁组织，其蛋白水平的变化趋势与基因表达的变化趋势相吻合。
desmuslin基因在慢性静脉功能不全发病中的作用及其转录调控机制研究 在上一个研究的基础上，去年获得了国家自然科学基金资助的后续研究项目。采用RNA干扰技术封闭desmuslin基因在正常静脉血管平滑肌细胞中的表达，观察细胞形态和超微结构的改变，了解desmuslin基因的表达缺失对血管平滑肌细胞的影响。并对desmuslin基因5’端上游序列的不同长度片段进行亚克隆、构建系列重组PGL2荧光素酶报告基因载体，转染体外培养的血管平滑肌细胞，通过检测Luc基因的一过性表达活性和电泳迁移率变动分析， 鉴定对desmuslin基因转录起在调节作用和上游区域，以阐明desmuslin基因在慢性静脉功能不全发病中的作用。此研究正在进行中。
白细胞及其相关分化抗原在慢性下肢静脉性溃疡发病中作用的研究 研究结果表明，外周血白细胞捕获和局部皮肤白细胞浸润与静脉性溃疡发病关系密切。血管内皮细胞数量增多，新生血管增多与静脉性溃疡发病相关。单核/巨噬细胞数量增多及肿瘤坏死因子－α（TNF-α）高表达在静脉性溃疡发病中有重要作用。CD95/Fas介导的细胞凋亡是静脉性溃疡发病的一个重要因素。
|